大鼠 8 羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)酶聯(lián)免疫檢測
試劑盒使用說明書 AE90828Ra
使用前仔細(xì)閱讀本說明書。本酶聯(lián)免疫試劑盒是基于雙抗體夾心技術(shù)原理，
來檢測大鼠 8 羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)，只能用于研究用途，不得用于醫(yī)學(xué)診斷。
用 途：用于大鼠血清、血漿及相關(guān)液體樣本中 8 羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)測
定。
工作原理
本試劑盒采用的是生物素雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測定樣品中
大鼠 8 羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)水平。向預(yù)先包被了大鼠 8 羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)
單克隆抗體的酶標(biāo)孔中加入 8 羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)，溫育；溫育后，加入生物
素標(biāo)記的抗 P 抗體。再與鏈霉親和素-HRP 結(jié)合，形成免疫復(fù)合物，再經(jīng)過溫育
和洗滌，去除未結(jié)合的酶，然后加入底物 A、B，產(chǎn)生藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)
化成zui終的黃色。顏色的深淺與樣品中大鼠 8 羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)的濃度呈正
相關(guān)。
試劑盒組成
試劑盒組成 48 孔配置 96 孔配置 保存
說明書 1 份 1 份
封板膜 2 片（48） 2 片（96）
密封袋 1 個(gè) 1 個(gè)
酶標(biāo)包被板 1×48 1×96 2-8℃保存
標(biāo)準(zhǔn)品 800pg/ml 0.5ml×1 瓶 0.5ml×1 瓶 2-8℃保存
標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 3ml×1 瓶 6ml×1 瓶 2-8℃保存
鏈霉親和素-HRP 3 ml×1 瓶 6 ml×1 瓶 2-8℃保存
生物素標(biāo)記的抗 P
抗體
0.5ml×1 瓶 1 ml×1 瓶 2-8℃保存
顯色劑 A 液 3 ml×1 瓶 6 ml×1 瓶 2-8℃保存
顯色劑 B 液 3 ml×1 瓶 6 ml×1 瓶 2-8℃保存
終止液 3ml×1 瓶 6ml×1 瓶 2-8℃保存
濃縮洗滌液 （20ml×20 倍）×1 瓶 （20ml×30 倍）×1 瓶 2-8℃保存
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需要而未提供的試劑和器材
1． 37℃恒溫箱。
2． 標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格酶標(biāo)儀。
3． 精密移液器及一次性吸頭
4． 蒸餾水，
5． 一次性試管
6． 吸水紙
注意事項(xiàng)
1． 從 2-8℃取出的試劑盒，在開啟試劑盒之前要室溫平衡至少 30 分鐘。酶標(biāo)包
被板開封后如未用完，板條應(yīng)裝入密封袋中保存。
2． 各步加樣均應(yīng)使用加樣器，并經(jīng)常校對其準(zhǔn)確性，以避免試驗(yàn)誤差
3． 嚴(yán)格按照說明書的操作進(jìn)行，試驗(yàn)結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn).
4． 為避免交叉污染，要避免重復(fù)使用手中的吸頭和封板膜。
5． 不用的其它試劑應(yīng)包裝好或蓋好。不同批號的試劑不要混用。保質(zhì)前使用。
6． 底物 B 對光敏感，避免長時(shí)間暴露于光下。
洗板方法
手工洗板方法：甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體；在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上鋪墊幾層吸水紙，酶標(biāo)板朝下
用力拍幾次；將稀釋后的洗滌液至少 0.35ml 注入孔內(nèi)，浸泡 1-2 分鐘。根據(jù)需
要，重復(fù)此過程數(shù)次。
自動(dòng)洗板：如果有自動(dòng)洗板機(jī)，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實(shí)驗(yàn)過程中
標(biāo)本要求
1．不能檢測含 NaN3 的樣品，因 NaN3 抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。
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2．標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取，提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行，提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實(shí)
驗(yàn)。若不能馬上進(jìn)行試驗(yàn)，可將標(biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
操作程序
1. 標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋：(本試劑盒提供原倍標(biāo)準(zhǔn)品一支，用戶可按照下列圖表在小
試管中進(jìn)行稀釋。)
400pg/ml 5 號標(biāo)準(zhǔn)品 120μl 的原倍標(biāo)準(zhǔn)品加入 120μl 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
200pg/ml 4 號標(biāo)準(zhǔn)品 120μl 的 5 號標(biāo)準(zhǔn)品加入 120μl 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
100pg/ml 3 號標(biāo)準(zhǔn)品 120μl 的 4 號標(biāo)準(zhǔn)品加入 120μl 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
50pg/ml 2 號標(biāo)準(zhǔn)品 120μl 的 3 號標(biāo)準(zhǔn)品加入 120μl 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
25pg/ml 1 號標(biāo)準(zhǔn)品 120μl 的 2 號標(biāo)準(zhǔn)品加入 120μl 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
2. 根據(jù)代測樣品數(shù)量加上標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)量決定所需的板條數(shù)。每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和空白
孔建議做復(fù)孔。每個(gè)樣品根據(jù)自己的數(shù)量來定，能使用復(fù)孔的盡量做復(fù)孔。
3. 加樣：1）空白孔，空白對照孔不加樣品，生物素標(biāo)記的抗 8-OHdG 抗體，鏈
霉親和素-HRP，只加顯色劑 A&B 和終止液，其余各步操作相同；2）標(biāo)準(zhǔn)品
孔：加入標(biāo)準(zhǔn)品 50ul，鏈霉親和素-HRP50ul(標(biāo)準(zhǔn)品中已事先整合好生物素
抗體，故不加)；3）代測樣品孔：加入樣本 40ul，然后各加入抗 8-OHdG 抗
體 10ul、鏈霉親和素-HRP50ul，蓋上封板膜，輕輕震蕩混勻，37℃溫育 60
分鐘。
4. 配液：將 30 倍濃縮洗滌液用蒸餾水 30 倍稀釋后備用。
5. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置 30 秒后
棄去，如此重復(fù) 5 次，拍干。
6. 顯色：每孔先加入顯色劑 A50ul，再加入顯色劑 B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃
避光顯色 15 分鐘.
7. 終止：每孔加終止液 50μl，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。
8. 測定：以空白空調(diào)零，450nm 波長依序測量各孔的吸光度（OD 值）。 測定應(yīng)
在加終止液后 10 分鐘以內(nèi)進(jìn)行。
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9. 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及對應(yīng)的 OD 值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程，再根據(jù)
樣品的 OD 值在回歸方程上計(jì)算出對應(yīng)的樣品濃度。也可以使用各種應(yīng)用軟
件來計(jì)算。
操作程序總結(jié)：
試劑盒性能：
1.樣品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù) R 值為 0.92 以上。
2.批內(nèi)與批間應(yīng)分別小于 9%和 15%
檢測范圍：
檢測范圍：5pg/ml→400pg/ml。
保存條件及有效期：
保存：2-8℃。
有效期：6 個(gè)月(2-8℃)。
準(zhǔn)備試劑，樣品和標(biāo)準(zhǔn)品
加入準(zhǔn)備好的樣品和標(biāo)準(zhǔn)品，生物素標(biāo)記的二抗和酶標(biāo)試劑，37℃反應(yīng) 60 分鐘
洗板 5 次，加入顯色液 A、B，37℃顯色 15 分鐘
加入終止液
10 分鐘內(nèi)讀 OD 值
計(jì)算
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Rat 8-Hydroxy-desoxyguanosine
ELISA Kit
Instruction
This kit is only for scientific research, and shall not be used as a clinical diagnosis of use. Purpose
This kit allows for the determination of 8-OHdG concentrations in Rat serum, cell culture
supernatant, and other biological fluids. Principle
The kit assay Rat 8-OHdG level in the sample，add Rat 8-OHdG antibody to microtiter plate
wells, after Incubating,add Biotinylated anti –8-OHdG -antibody , then Combined
Streptavidin-HRP, become complex, after Incubating and washing Compley, Add TMB
substrate solution,TMB substrate becomes blue color, reaction is terminated by the addition of
a sulphuric acid solution and the color change is measured spectrophotometrically at a
wavelength of 450 nm. The concentration of 8-OHdG in the samples is then determined by
comparing the O.D. of the samples to the standard curve. Materials provided with the kit
Materials provided with the
kit 48determinations 96 determinations Storage
User manual 1 1
Closure plate membrane 2 2
Sealed bags 1 1
Microelisa stripplate 1 1 2-8℃
Standard：800pg/ml 0.5ml×1 bottle 0.5ml×1 bottle 2-8℃
Standard diluent 3ml×1 bottle 6ml×1 bottle 2-8℃
Streptavidin-HRP 3ml×1 bottle 6ml×1 bottle 2-8℃
Biotinylated anti –8-OHdG
-antibody
0.5ml×1 bottle 1ml×1 bottle 2-8℃
Chromogen Solution A 3ml×1 bottle 6ml×1 bottle 2-8℃
Chromogen Solution B 3ml×1 bottle 6ml×1 bottle 2-8℃
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Stop Solution 3ml×1 bottle 6ml×1 bottle 2-8℃
wash solution
（20ml×20 fold）
×1bottle
（20ml×30 fold）
×1bottle
2-8℃
Materials required but not supplied
1. 37 ℃ incubator
2. Standard microplate reader(450nm)
3. Precision pipettes and Disposable pipette tips. 4. deionized water. 5. Disposable Test tube
6 Absorbent paper
Important notes
1. The kit takes out from the refrigeration environment should be balanced 15-30 minutes in
the room temperature, ELISA plates coated if has not use up after opened, the plate should
be stored in Sealed bag. 2. add Sample with sampler Each step, And proofread its accuracy frequently, avoids the
experimental error. 3. Please according to use 8-OHdGtruction strictly, The test result determination must take
the microtiter plate reader as a standard. 4. Use new disposal plastic pipette tips and Closure plate membrane for each standard, in
order to avoid cross contamination. 5. Do not mix reagents with those from other lots. 6. The substrate evade the light preservation. Specimen requirements
1. extract as soon as possible after Specimen collection,and according to the relevant
literature, and should be experiment as soon as possible after the extraction. If it can’t, specimen can be kept in -20 ℃ to preserve, Avoid repeated freeze-thaw cycles. 2. Can’t detect the sample which contain NaN3, because NaN3 inhibits HRP active.
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Assay procedure
1. Dilute and add sample:Dilute Original density Standard as follow table:
400pg/ml 5 Standard 120μl Original density Standard+120μl Standard diluent
200pg/ml 4 Standard 120μl 5 Standard+120μl Standard diluent
100pg/ml 3 Standard 120μl 4 Standard+120μl Standard diluent
50pg/ml 2 Standard 120μl 3 Standard +120μl Standard diluent
25pg/ml 1 Standard 120μl 2 Standard +120μl Standard diluent
2. according testing Sample numbers to define how many wells nedd, Standard and blank
suggested Do holes. 3.add sample：1) blank wells: (blank comparison wells don’t add sample , Biotinylated anti –8-OHdG -antibody and Streptavidin-HRP ,other each step operation is same); 2) Standard
wells: add Standard 50μl and Streptavidin-HRP 50μl; 3) testing Sample wells: add sample
40μl,then add anti –8-OHdG-antibody 10μl , Streptavidin-HRP 50μl. closing plate with Closure
plate membrane ,incubate for 60 min at 37℃. 4.Configurate liquid: 30-fold(or 20-fold) wash solution diluted 30-fold (or 20-fold) with distilled
water and reserve. 5.washing：Uncover Closure plate membrane, discard Liquid, dry by swing, add washing buffer
to every well, still for 30s then drain, repeat 5 times, dry by pat. 6.color：Add Chromogen Solution A 50ul and Chromogen Solution B to each well, evade the
light preservation for 15 min at 37℃
7.Stop the reaction ： Add Stop Solution50μl to each well, Stop the reaction(the blue color
change to yellow color). 8.assay：take blank well as zero , Read absorbance at 450nm after Adding Stop Solution and
within 10min. 9. Calculate of result
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