免疫組化具體步驟中的一些問(wèn)題

問(wèn)：

我現(xiàn)在剛開(kāi)始做石蠟切片免疫組化,具體操作過(guò)程中有些問(wèn)題想要咨詢(xún)一下
1.脫蠟至水:二甲苯I II 各10分鐘后 100% 95% 85% 75%酒精各多久呢（因看各個(gè)版本的介紹都不同）
弱弱的問(wèn):只搞一個(gè)濃度的酒精如95%時(shí)間稍微長(zhǎng)一些可以嗎
2.抗原修復(fù):可以枸櫞酸加熱至沸騰再放入切片保溫5-10分鐘嗎?冷卻至室溫這步可以將切片拿出來(lái)冷嗎?
3.加一抗后37度2-3小時(shí)這步要怎么操作,切片怎樣放在水浴箱呢?
4.DAB用前幾天的可以嗎?一定要現(xiàn)用現(xiàn)配嗎?
5.蘇木精復(fù)染要幾分鐘呢?弱弱的問(wèn)一下這步的作用是什么?
另外聽(tīng)說(shuō)這步完了在透明之前要在稀鹽酸中過(guò)一下有這種說(shuō)法嗎?作用是什么呢?

答：

1,以后各5分鐘,是搞兩個(gè)濃度的酒精,如95%,因?yàn)橛镁昧司蜁?huì)稀釋.
2,我是這樣做的:微波（MW）加熱過(guò)程如下：在盒內(nèi)放入200ml檸檬酸緩沖液（PH6.0±0.1），并蓋上帶有小孔的蓋子，微波加熱至沸騰；將脫蠟水化后的組織切片置于耐高溫塑料切片架中，放入已沸騰緩沖液中，采用微波爐中等功率800W,微波爐選用解凍檔的國(guó)產(chǎn)家用微波爐（建議用醫(yī)用微波爐），中檔繼續(xù)處理10-20分鐘；取出微波塑料缸冷卻至室溫，從緩沖液中取出玻片，片子經(jīng)蒸餾水沖洗二次，之后用PBS（PH7.2-7.4）沖洗兩次，每次3分鐘。
經(jīng)高溫后冷卻這一步不能省略.個(gè)人觀點(diǎn)，15分鐘的冷卻是必須的：1、如這一步省略，對(duì)于有些抗體而言，會(huì)降低AR-IHC染色強(qiáng)度。2、突然從高溫到低溫可導(dǎo)致組織片掉片。3、可能引起形態(tài)學(xué)的變化。（所以不要拿出來(lái)呀）
3,放入濕盒中.
4,DAB必須現(xiàn)用現(xiàn)配,并且配后30分鐘內(nèi)用完.
5,復(fù)染時(shí)間不等,有的30S,有的幾分鐘,根據(jù)組織,你自己多做幾張摸索一下.作用是染細(xì)胞核.
另外,在透明之前是分化,用1%酒精鹽酸,如果復(fù)染太深了,你可以分化,一般不用.
GOOD LUCK!

1）脫蠟的時(shí)候酒精的濃度要從高向低，我一般是二甲苯--二甲苯--100％酒精--100％酒精--95％酒精--80％酒精
2）抗原修復(fù)比較重要，一般是在90度以上15分鐘，先把片子放進(jìn)去然后加熱，15分鐘后讓其自然冷卻，也可以將抗原修復(fù)的容器放在一盆冷水里，讓其環(huán)境冷卻后再將片子拿出來(lái)
3）我一般一抗孵育都是放在4度冰箱里過(guò)夜
4）DAB要現(xiàn)配現(xiàn)用，在30分鐘內(nèi)用完，我一般DAB顯色30秒，效果還可以，但具體情況還是要具體分析，在顯微鏡下看情況而定，但是如果超過(guò)10分鐘都沒(méi)有顏色的話就說(shuō)明染色失敗了
5）蘇木素是染細(xì)胞核的，我一般染1分鐘，可以自己摸索一下
6）復(fù)染后可以用1％酒精鹽酸分化，通過(guò)改變其PH值來(lái)分化胞漿的顏色。然后用淡氨水返藍(lán)。
7）如果你的片子一直不出結(jié)果，先看看自己的操作有沒(méi)有問(wèn)題，二抗是不是針對(duì)一抗來(lái)源的特異性抗體，如果操作各步驟都沒(méi)有問(wèn)題，zui先考慮的就是一抗的問(wèn)題，你可以將你的免疫組化片子發(fā)來(lái)看看，大家一起討論一下。