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        免疫共沉淀 簡介
      2. 發布日期:2009-06-17      瀏覽次數:2693
        • 蛋白質間相互作用研究方法:免疫共沉淀
          1.用磷酸鹽緩沖液洗30塊10 cm培養板上的適宜細胞。刮去每塊板上的細胞到1 ml冰冷的EBC裂解緩沖液中。
          2.將每毫升細胞懸液轉移到微量
          離心管中,在微量離心機上4℃以zui大速度離心15 min。
          3.收集上清(約30 ml)并加入30μg的適當
          抗體,4℃搖動免疫沉淀物1 h。
          4.加入0.9 ml的蛋白質A-Sepharose 懸液,4℃搖動免疫沉淀物30 min。
          5.用含900 mmol/L NaCl的NETN洗蛋白A-Sepharose混合物,再重復洗5次。zui后,用NETN洗一次。
          6.吸出混合物的液體部分。加入800μl的1×SDS膠加樣緩沖液到球珠中,煮沸4 min。
          7.將樣品加入到大孔的不連續SDS-PAGE梯度膠中,在10 mA的恒定電流下電泳過夜。
          8.通過考馬斯藍染色觀察蛋白質泳帶。
          9.從膠上切下目標帶,將其放到微量
          離心管中,用1ml 50%乙腈洗兩次,每次3 min。
          10. 用胰蛋白酶消化膠中的蛋白質,再將肽電洗脫。
          11. 通過窄孔
          液相色譜分離肽。將收集的肽在ABI 477A或494A機器上進行自動Edman降解測序

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