概述：

• 如何借助 DuraClone 通過流式細胞術對人外周血單核細胞 (PBMC) 進行染色，以進行 T 細胞受體分析。

• 如何運用 CytoFLEX 流式細胞儀和 DuraClone 對 TCR 亞群進行鑒定。

介紹：

T 細胞在免疫系統(tǒng)的功能與調(diào)控中扮演著重要角色。成熟的 T 細胞可以同時表達 CD3 和 T 細胞受體 (TCR)。基于 TCR: 有 αβ T（T 細胞庫的 95%）和 γδ T（T 細胞庫的 5%）兩種類型，它們能夠進一步分裂成兩個亞群。又因 TCR αβ T 細胞分別與 MHCII 類或 MHC I 類抗原相結(jié)合的親和力，其可以隨即區(qū)分為 CD4 T 細胞或 CD8 T 細胞。γδ T 細胞的zui大子集可以表達 Vδ2 TCR 復合物。γδ T 細胞的較小子集可以表達 Vδ1 TCR 復合物。研究 TCR γδ Vδ2 T 細胞和 TCR γδ Vδ1 T 細胞，對于母胎¹ 和同種移植耐受² 是非常重要的，而了解眾多 T 細胞亞群，對于各種常規(guī)和病理學研究也是相當重要的。DuraClone IM Panel，這是一種在室溫下狀態(tài)穩(wěn)定的干粉試劑混合物。根據(jù) ONE Study 以及專業(yè)的流式細胞術實驗室提供的設計建議，進行試管配制，用于臨床研究領域。本文將介紹在 CytoFLEX 上運行裝有正常 PBMC 的 DuraClone IM TCR 試管的情況。

方法：

• 人外周血單核細胞 (PBMC) 分離

用 1X PBS + 3% FCS 將 10 mL 全血稀釋至 21 mL。取 6 mL Ficoll（Sigma: Histopaque 1077，產(chǎn)品目錄號：10771）注入 3 個 15 mL 錐形瓶中。以較大角度傾斜 10 mL 移液管，并將 7 mL 經(jīng)過稀釋的血樣加入 Ficoll 中。經(jīng)過稀釋的血樣將慢慢覆蓋到 Ficoll 上。在剎車關閉的情況下，將細胞放入吊桶式水平轉(zhuǎn)頭離心機中，以 1500 RPM 的轉(zhuǎn)速，離心 30 分鐘。將上清液抽出，并收集樣品，將之放入 PBS + 5% FCS 中洗滌。重懸細胞聚合體，并用 ViCell 儀對其進行計數(shù)，然后將之稀釋至zui終濃度為每個試管 1 x 10⁶ 個細胞/100 μL，以進行染色。

• DuraClone 染色流程

將一百萬個 PBMC 加入 DuraClone IM TCR 試管中，隨后渦旋 5 秒鐘。在室溫、避光條件下孵育 20 分鐘后， 用 3 mL PBS 洗滌 PBMC，400 g 離心 5 分鐘。將 PBMC 重懸于 250 μL PBS 中，并從 CytoFLEX 上獲取檢測結(jié)果。

結(jié)果：

• 用 DuraClone IM TCR 試管快速構(gòu)建 TCR 子集

本文采用 DuraClone IM TCR 試管對正常 PBMC 進行染色，表明通過 CytoFLEX 即可快速對 T 細胞子集予以測定。大約 30 分鐘后，PBMC 能夠表征至相應的區(qū)域。使用 DuraClone IM TCR 試管是一項切實可行的方案，能夠取代繁雜的染色流程。

參考文獻：

1. Pregnancy and gamma/delta T cells: taking on the hard questions.Mincheva-Nilsson L. Reprod Biol Endocrinol.2003 Dec 2; 1:120.Review.

2. Characteristics of Vδ1 (+) and Vδ2 (+) γδ T cell subsets in acute liver allograft rejection. Yu X, Liu Z, Wang Y, Wang H, Zhang M,Sun Y, Su H, Jin L, Wang F, Shi M. Transpl Immunol.2013 Dec; 29(1- 4):118-22.

注：

本應用說明所提供的結(jié)果展示了貝克曼庫爾特 CytoFLEX 流式細胞儀上產(chǎn)生的結(jié)果。由于分析儀性能之間存在差異，因此，作者無法確保使用其他流式細胞儀也能夠獲取相似結(jié)果。

圖 1 采用 DuraClone IM TCR 試管快速構(gòu)建 T 細胞受體子集

通過 CD45 染色在淋巴細胞中圈選 PBMC (A)。隨后基于 TCR γδ 或 TCR αβ (C) 的表達圈選 Cd3+ 淋巴細胞 (B)。γδ T 細胞可對 Vδ1 和 Vδ2 表達進行表征 (D)。αβ T 細胞可對 CD8 和 CD4 表達進行表征 (E)。